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之前的文章提到,细胞内记录技术难以对离子通道行为进行研究,因为膜电位的变化与某些离子通道的门控机制相耦合。电压钳可以将膜电位固定(“钳制”)在恒定值,并直接记录通过细胞膜的电流。因此,电压钳通常用于在全细胞或单通道水平上记录通过电压门控或配体门控离子通道的电流运动,或记录由于作用于离子受体的神经递质而产生的突触后电流。离子通过电动转运蛋白的运动也可以在这种模式下测量。目前电压钳模式是膜片钳技术最常用的记录方式。

玻璃电极的制备

膜片钳玻璃电极通常由薄的(有时也用厚的)硼硅酸盐或石英毛细管玻璃,使用水平或垂直电极拉制仪拉制而成。最典型的情况是,将一块毛细玻璃管夹在加热片周围,围绕加热片中心加热后进行拉伸,通常需要重复加热拉伸多次,在加热拉伸循环之间使用空气射流冷却加热片。最终将毛细玻璃管拉断,形成两个尖端非常细(1–3μm)的电极。可以控制加热片的温度、拉伸运动的速度、时间和压力以及重复拉伸的循环次数,以确定玻璃电极的锥度和最终玻璃电极尖端的直径。为了获得完全清洁和光滑的尖端或进一步调整玻璃电极尖端的直径(通常为增加电极阻抗Rp),建议使用抛光仪对尖端进行加热抛光。为了获得最佳的整体效果,玻璃电极应小批量制备,在制备当天使用,并储存在无尘环境中。

如果是进行最低噪声、高分辨率的记录,如单通道记录,贴片电极可在尽可能靠近尖端的位置涂上可通过加热固化的惰性疏水剂,如蜂蜡、石蜡或专用的试剂 Sylgard。涂抹这些试剂时一般需要在电极内施加正压,以防止电极尖端被封闭;涂层电极减少了由于进入槽液而可能在电极壁上产生的杂散电极电容。

玻璃电极内填充导电溶液,通常使用细针头、导管和注射器将电极液灌入电极,有时还需要将电极尖端浸泡在电极液中以保证电极尖端没有气泡。也可使用带有细丝的毛细管玻璃拉制电极,这种带芯的玻璃电极能够更好地保证电极液充满电极尖端。电极溶液可根据记录模式进行调整,比如全细胞记录模式中,细胞内容物会与电极溶液混合。因此,电极溶液可以设计为与生理性细胞内溶液一致,有助于分离不同的电压门控或配体门控离子通道电导。类似地,电极溶液可由 ATP 或 GTP 盐、诸如磷酸肌酸的试剂和诸如 HEPES 或 EGTA 缓冲剂补充。细胞内溶液的 pH 值(约等于 7.4)和渗透压(约为 300–320 mOsM/l)也可以调整为生理值,以尝试改善细胞健康和记录时长。如下文所述,电极溶液与全细胞记录模式的细胞内容物的混合可用于直接向细胞装载可扩散药物、第二信使化合物(例如细胞信号成分)和/或标记化合物。类似地,可以将试剂添加到电极溶液中,以与胞外结构域(细胞贴附模式或内面向外模式)或胞内结构域(外面向外模式)相互作用。此外,穿孔全细胞膜片钳模式中,在专业穿孔电极溶液中会添加造孔抗生素,以促进形成穿孔模式封接。

灌入电极液后,将玻璃电极紧密固定在一个密封的电极夹持器上,电极夹持器包含一根氯化银( Ag/AgCl )导线,该导线浸入电极溶液中并有效地传导离子。电极夹持器连接到连接到膜片钳放大器。同时电极夹持器安装在微操作器上,便于精确控制玻璃电极的移动和定位,并具有高度稳定性。将电极移动到感兴趣的记录位置,通常处于适当显微镜台上的记录室内。通过使用含有三通阀门的塑料管,可以向电极内施加或释放压力,以形成不同的记录模式。通过使用压力计测量精确压力,可以对该步骤进行标准化。

不同膜片钳记录模式的应用

单个细胞记录

单个细胞膜片钳记录通常通过贴在细胞爬片上孤立的细胞来实现,细胞爬片放置在专门的记录槽中,通常有受控的细胞外溶液流入和流出以及连接接地电极(可通过大约 3M KCl 琼脂盐桥将记录期间会发生的基线“漂移”降至最低)。记录槽固定在可移动的平台或“倒置”显微镜的工作台上。倒置显微镜的光源位于记录室的上方,物镜位于记录室的下方,并允许微操上的电极有一个适当大的工作距离。微操作器牢固地连接在可移动平台上,或安装在单独的隔离平台上;此类微操通常是液压或压电控制的,并且是低噪音的,可提供精细的运动控制,以允许玻璃电极以高水平的稳定性移动到合适位置。摄像机可连接至显微镜并将视频传输至视频监视器,以便于识别细胞和定位电极。整个装置放在防振台上,周围有法拉第笼以屏蔽电气干扰。最终需要使该系统可提供稳定的膜片钳记录,无外来噪音。

细胞(神经元、胶质细胞、肌肉等)可从其固有组织中分离出来,并被贴到细胞爬片上以进行急性记录,或可在记录前保持在原代培养中。现在越来越多的细胞,如遗传稳定的细胞系或干细胞,也可以类似地进行膜片钳记录。通常,感兴趣的离子通道或离子受体亚单位或转运蛋白可在适当的细胞表达系统(例如,HEK、CHO、COS 或类似物)中瞬时或稳定表达。理想情况下,这种“重组”细胞干扰性内源性蛋白质较少,因此可以研究“纯”离子通道群体。相比之下,天然(或天然衍生)细胞除了包括感兴趣的离子通道也可能含有其他各种各样的干扰离子通道。因此,可以通过改变电极液成分,以选择性地记录感兴趣的电流,通常通过调整主要内部阳离子浓度。例如,为了记录全细胞的 K+ 电流,需要使用一种生理性的约 140 mM KCl 基细胞内溶液(或葡萄糖酸钾或天冬氨酸钾以避免 Cl- 通道的激活)。为了记录全细胞的 Na+ 电流,可以使用含有生理盐水的细胞内溶液,以及 140 mM CsF 或 CsMeSO4 以减少外向 K+ 电流。为了记录全细胞的 Ca2+ 电流,消除干扰污染电导是至关重要的步骤,例如向内的 Na+ 电流(此外,Na+ 也可以部分通过 Ca2+ 电流通道)和向外的 K+ 电流。因此,可使用约 140 mM CsCl 或使用天冬氨酸铯以避免额外 Cl- 通道激活。此外,可以研究具有额外激活要求的电流;例如,BKCa 电流是电压门控和 Ca2+ 依赖的,可使用约 140 mM KCl 记录,游离 Ca2+ 浓度使用 Ca2+缓冲液(如 EGTA 或 BAPTA)滴定。类似地,配体门控电流,如兴奋性离子受体中的 Na+ 电流或抑制性离子受体中的 Cl- 电流,可使用适当的细胞内溶液记录。这些通道可以在重组细胞或天然细胞中选择性表达的情况下进行研究。

通常,使用模拟生理状态的细胞外液用于对急性分离细胞进行膜片钳记录。不过,自行调配成份的细胞外液也可以有利于更好的记录特殊离子通道。例如,对于 Ca2+ 电流记录,Ba2+ 通常用作电荷携带离子,因为 Ba2+ 通过 Ca2+ 通道的渗透率比 Ca2+ 本身还高,并且同时也避免了 Ca2+ 依赖性失活等过程。对于 Na+ 电流记录,细胞浴液中的 Na+ 浓度可以通过使用不含 Na+ 的盐(如氯化胆碱)来降低,这样就可以降低 Na+ 电流密度。一个更特殊的例子是 K+ 电流记录,细胞浴液中可以添加 Rb+,Rb+ 可以延长 K+ 通道的尾电流,这样就可以对通道失活动力学等进行详细解释。像这样的离子通道电导的分离可借助于药理试剂和专用电压钳 protocol。例如,使用超极化(pre)脉冲使 Na+ 电流失活,有时也可以使瞬态 K+ 电流失活。细胞外溶液c成分的调配也可用于研究电动转运体电流的离子依赖性,特别是在重组细胞系统中选择性表达时。

对于分离的细胞,尤其是长期培养的细胞,细胞通常有延伸的趋势(如神经元中的突起),这可能导致钳制保真度问题(通常称为“空间钳制”问题)。这种情况下,注入的电压可以消散到这些伸展或者突起中,从而使放大器读取指令电压发生错误,导致不能有效地进行电压钳制。当离子通道蛋白在具有小电容的某个区域细胞膜中高度表达时就会出现这种状况。空间钳位问题最常见的表现是在小电压增量下电流急剧增加,而不是理想的有刻度、平滑的电流“开启”。一般情况下,电流-电压关系可通过不同的波尔兹曼函数拟合;在测量的不同参数时,斜率因子“k”(电流变化的 mV/e 倍)表示电流对于激活电压的依赖性;k 值很低(即 <2–3mV)可能表示空间钳位不良。

$$
\frac{g}{g_{max}}=1-\left(1+e^{\frac{v_{m}-v_{1/2}}{k}}\right)^{-1}
\tag{波尔兹曼函数}
$$

其中 g 为全细胞激活电导,gmax 为全细胞最大激活电导。V 为脉冲电压,V1/2 为通道激活 50% 时的脉冲电压。k 为斜率。而电导 g 的计算方法为:

$$
g=\frac{1}{v_{m}-v_{rev}}
$$

其中 Vrev 为翻转电位。

细胞贴附模式记录可以在单细胞中进行。通常,细胞放电活动最好在组织切片中记录(见急性组织切片记录),在组织切片中可以更好地保持主动输入。不过,具有较低离子通道/转运体密度的大型分离细胞也可以使用大膜片钳(或巨膜片钳)记录。比如说使用爪蟾卵母细胞作为哺乳动物表达系统的替代物,可以使用巨膜片钳以评估表达蛋白的活性。

电流钳记录通常用于监测静息膜电位,在电兴奋的急性分离或原代培养神经元中,用于测量再生动作电位。对于后者,应用一系列超极化和去极化电流脉冲来测量被动和主动膜特性(通常以 50–100pA 的步长增量)。对于电流钳记录,一般使用的电极液和细胞浴液成分都是模拟生理细胞内液和细胞外液的成分。

更专门的膜片钳记录也可以从分离细胞内的细胞器膜上进行,通常应用于非兴奋细胞。虽然通常可以使用专门的膜制剂(见急性组织切片的高级记录),但也可以对分离细胞进行记录。比如细胞内细胞器膜(如线粒体)的“双膜片钳”记录。在这种结构中,内部高电阻电极由外部电极包围,外部电极用于达到细胞内记录状态,然后将外部电极取出,露出内部电极尖端,最后内部电极尖端在细胞器膜上形成千兆欧姆的封接。与细胞器膜的小尺寸相对应,在该模式中使用专门的、相对高电阻的电极。

膜片钳技术可以与分离细胞的成像技术结合使用,以揭示离子通道激活的生理后果。例如,在分离和培养的神经元上同时膜片钳记录和 Ca2+ 成像,可以揭示这 Ca2+ 通道介导的第二信使的来源和空间调节。

单通道记录

使用单通道记录技术可以研究单个离子通道的活动,该技术可以模式下记录:细胞贴附式记录、外面向外和内面向外式记录。在所有情况下,都需要膜和电极之间的封接质量都非常高(>20GΩ),并且与全细胞记录模式不同,电极尖端开口处的膜没有破裂1,2。这是为了确保流过电极尖端的电流都是来自其下方膜中包含的离子通道。由于切除的膜片非常小,因此膜片中仅有数个甚至单个离子通道。

单通道电流很小(通常为单位数pA),电导通常为 2–500pS。电导可理解为电阻的倒数,因此,单通道记录中的封接电阻必须大大高于全细胞记录通常所需的封接电阻。为了降低噪音水平并提高电流记录的分辨率,需要极高的电阻封接。

单个离子通道的电流可以被识别为两个电导水平之间的瞬时波动,因为通道通过对应于打开或关闭的状态进行转换。离子通道的打开和关闭通常被描述为一个随机过程,这意味着这些是具有概率分布的随机事件,可以进行统计分析。它也可以被描述为马尔可夫过程,其中未来状态的概率仅取决于当前状态,而不取决于之前发生的事件序列。一些离子通道可能在三个或三个以上的电导水平之间波动,这可能是膜片中含有不止一个离子通道,也可能指完全打开和完全关闭之间的中间状态。

离子通道的开放和闭合状态是离散事件,其振幅和持续时间可以分析并推断其活动和动力学。此类分析已经有先行者制定了不同的研究策略,可以查阅这些文献自行研究3-7

急性组织切片记录

与使用单细胞的实验相比,使用急性组织(通常是大脑)切片的实验需要不同的“直立”显微镜设置(见图3)。为了让实验者从一个合适的细胞中定位和记录,直立式显微镜的物镜位于组织上方,光源位于下方。除了这一关键区别之外,实验装置在很大程度上类似于用于上述单细胞的装置。在记录槽内,通常需要使用“网格片”(通常由铂丝和尼龙线或网制成)将组织切片固定到位。组织灌流含羧基的溶液,如人工脑脊液(aCSF),以使组织切片保持活性,用于脑切片记录;与细胞内溶液一样,细胞外溶液的 pH 值和渗透压可调节至生理值。低倍率物镜通常用于定位感兴趣的组织区域,水浸物镜(60倍放大)用于识别合适的细胞进行记录,通常使用差分干涉对比度(DIC)光学系统结合红外照明(IR-DIC)。在识别到细胞后,可以小心地提起物镜,由此细胞外溶液的表面张力将允许更大的工作距离,以便使用合适的微操作器操纵玻璃电极。

在电压或电流钳制模式下的自发细胞放电活动通常可以在脑切片中测量到,脑切片中神经元保持网络连接,互相之间有信号输入,因此,可以研究更具生理相关性的情况。此时,通常使用细胞贴附式记录模式。从海马或小脑等区域的脑切片中识别出主细胞的细胞体,可以对其进行全细胞记录,通常用于记录由神经递质产生的自发突触后电流。这些神经递质(通常)从突触前的突触小体释放到离子性突触后受体上刺激突触后细胞产生动作电位。而在河豚毒素阻断电压门控钠通道的情况下,会阻止动作电位的产生,于是可以记录与动作电位无关的(所谓的微型)突触后电流。刺激电极(例如连接到恒压刺激器上的双极钨电极)用于激活输入到主神经元的输入,可用于测量诱发的突触后电流。如上所述,对于分离的细胞,电极液可添加各种离子通道受体阻滞剂。例如,记录由离子通道受体介导的钠离子内流引起的兴奋性突触后电流,如谷氨酸、乙酰胆碱或5-HT配体门控的电流,记录液 aCSF 可以含有 140mM 葡萄糖酸盐(或Cs葡萄糖酸盐)基细胞内溶液的 5mM NaCl,并且通常可以使用抑制性(GABA/甘氨酸)离子受体阻滞剂。而记录由 Cl- 引起的抑制性突触后电流可通过离子型受体的作用,例如通过 GABA 或甘氨酸配体、此时记录液 aCSF 含有约140 mM CsCl 通常可以添加兴奋性(谷氨酸)离子型受体阻滞剂;在这里,由于 GABA 和甘氨酸配体门控电流有一些相似之处,因此也通常使用相应的阻断剂。在这些情况下,电压钳模式记录了细胞内自发的、微型的或诱发的突触后电流,这些电流通常保持在静息膜电位周围,而在静息膜电位周围,各个电荷携带离子的驱动力很高。

全细胞配体门控电流也可以使用上述分离或培养细胞的类似溶液从脑切片中的细胞记录。由于存在广泛的树突或轴突投射,存在与电压门控传导的体细胞记录相关的明显的潜在空间钳问题,这些问题在很大程度上干饶了全细胞记录在脑切片的主要神经元中进行电压钳测量。因此,穿孔膜片器技术以及单通道膜片钳技术更适合更好的进行电压钳制。

细胞内的细胞器膜记录

最近的进展进一步促进了细胞膜膜片钳记录的进步。先前的几项研究使用了脂质双层膜,其中纯化的离子通道被重建,单个通道的活动通过膜片钳放大器记录。然而,这种活动,特别是细胞内膜的活动,是高度自发性的,往往产生模棱两可的数据。事实上,膜片钳也可以对分离细胞内的细胞内膜进行记录。这类记录在技术上要求很高,目前越来越多的文献报告特制的细胞内膜制剂,包括线粒体、内溶酶体和肌浆/内质网,以及由此产生的膜片钳记录。这里常见的例子是使用从细胞内线粒体膜和整个溶酶体制剂制备的有丝分裂体,此类制剂需要更高电阻的贴片电极,并且可能受益于对外部溶液的修饰,以最好地反映细胞内膜所经历的环境,例如用于溶酶体膜的酸性溶液(pH~5.0)。在这种分离膜制剂中,所有主要膜片钳记录模式都可以进行记录。

在体膜片钳

最后,与离体细胞和组织切片记录所不同的是在体膜片钳记录方式的进步,以及在麻醉下或清醒时、头部固定或自由移动的动物中进行膜片钳记录的能力。这一点已开始通过全细胞记录来实现,全细胞记录已经克服了成功率低的问题,原理主要与较差的封接阻抗记录有关8。为了在中枢神经系统中记录,通常需要开颅手术和精细的切除脑膜;精细控制形成封接和压力/吸力有助于膜片钳记录。使用穿孔全细胞记录等干预措施有助于维持稳定性和延长在体膜片钳记录时间。

参考文献

[1]Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth F (1981) Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch 391:85–100

[2]Sigworth FJ, Neher E (1980) Single Na+ channel currents observed in cultured rat muscle cells. Nature 287:447–449

[3]Colquhoun D, Sigworth FJ (1983) Fitting and statistical analysis of single-channel records. In: Sakmann B, Neher E (eds) Single-channel recording, 2nd edn. Springer, New York

[4]Sigworth FJ, Sine SM (1987) Data transformations for improved display and fitting of single-channel dwell time histograms. Biophys J 52:1047–1054

[5]Hawkes AG, Jalali A, Colquhoun D (1992) Asymptotic distributions of apparent open times and shut times in a single channel record allowing for the omission of brief events. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 337:383–404

[6]Tveito A, Lines GT, Edwards AG, McCulloch A (2016) Computing rates of Markov models of voltage-gated ion channels by inverting partial differential equations governing the probability density functions of the conducting and non-conducting states. Math Biosci 277:126–135

[7]Laver DR (2001) The power of single channel recording and analysis: its application to ryanodine receptors in lipid bilayers. Clin Exp Pharmacol Physiol 8:675–686

[8]Wang Y, Liu YZ, Wang SY, Wang Z (2016) In vivo whole-cell recording with high success rate in anaesthetized and awake mammalian brains. Mol Brain 9:86

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